KRIOPRESERVASI LEUKOSIT

PENDAHULUAN

Secara teoritis, kriopreservasi berasal dari kata krio yang berarti beku, dan preservasi yang berarti penyimpanan pada temperatur rendah. Jadi kriopreservasi adalah teknik penyimpanan materi genetik dalam keadaan beku pada temperatur rendah. Tujuan utama dari teknik ini adalah untuk menyimpan, memelihara, dan menjamin kelangsungan hidup suatu materi genetik. Hal ini berarti bahwa penyimpanan sel dengan menggunakan teknik kriopreservasi diharapkan nantinya dapat mempertahankan daya hidupnya yang dicirikan dengan tetap berfungsinya sel baik secara biologis dan fisiologis.

Penyimpanan sel dengan teknik kriopreservasi memiliki keuntungan dan kerugian. Adapun keuntungannya adalah pemanfaatan sel yang tersedia maupun surplus sel sebagai stok sel yang dapat disimpan dalam waktu tidak terbatas (Boediono 2005) asalkan media tempat penyimpanan (kontainer) tetap terisi N₂ cair, dapat dikoleksi setiap saat, dapat digunakan kapan saja bila dibutuhkan, melestarikan plasma nutfah langka (Cseh, Solti 2000) dan tidak perlu mengimpor hewan dengan materi genetik yang baik. Sedangkan kerugiannya adalah biaya operasional pelaksanaannya sangat mahal, tenaga pelaksana harus memiliki skill yang tinggi, dan hanya sel yang berkualitas baik yang layak disimpan dalam keadaan beku (Supriatna, Pasaribu 1992).

KRIOPRESERVASI DI ALAM

Organisme hidup memiliki sejumlah besar kandungan air, maka tidak terelakkan terjadinya pembentukan kristal es dalam proses pembekuan organisme. Di antara amfibi dan serangga yang dapat mentolerir pembekuan, terdapat sejumlah variasi yang luas dalam mentolerir proeses pembekuan yang mereka alami. 

Menurut sebuah artikel pada edisi 1990 issue of SCIENTIFIC AMERICAN ["Frozen and Alive", by Ken & Janet Storey] dalam majalah Cryonic 1991, spesies katak tertentu bisa menghabiskan waktu berhari-hari atau minggu dengan 65 persen air dari tubuh mereka sebagai es. Beberapa amfibi mencapai perlindungan mereka karena gliserol diproduksi oleh hati mereka. Gliserol adalah "antibeku", mengurangi formasi es dan menurunkan titik beku). Gliserol (gliserin, seperti glikol etilena (mobil anti-freeze) adalah krioprotektan.

Pada serangga krioprotektan yang paling sering digunakan gula (glukosa). Serangga juga menahan diri dari aktifitas makan, hal ini disebabkan karena metabolisme yang melambat pada suhu lingkungan yang rendah. Kumbang arktik dewasa (Pterostichus brevicornis) biasanya bertahan pada suhu di bawah -35ºC. Kumbang ini telah dibekukan di laboratorium pada suhu -87ºC selama 5 jam tanpa cedera jelas, yaitu mereka menunjukkan  kegiatan terkoordinasi seperti berjalan, makan, dan respon penghindaran, dan tidak ditemukannya kelumpuhan.

METODE KRIOPRESERVASI

Ada dua prinsip penting yang harus diperhatikan apabila menggunakan teknik kriopreservasi, yaitu (1) bila terjadi dehidrasi (pengeluaran air dalam sel) maka akan terjadi kekeringan yang hebat di dalam suatu sel sehingga akan terjadi kerusakan pada sel, dan (2) bila tidak terjadi dehidrasi maka terbentuk kristal-kristal es yang besar yang dapat merusak sel, jaringan ataupun materi genetik lainnya. Dengan demikian perlu diperhatikan proses pemindahan air keluar masuk membran baik dehidrasi sebelum deep freezing maupun rehidrasi setelah thawing (pencarian kembali).

Berdasarkan fenomena fisik, teknik kriopreservasi dibedakan atas dua metode yaitu metode konvensional dan vitrifikasi (Rall, Fahy 1985; Supriatna, Pasaribu 1992). Pada metode konvensional pembawa materi genetik (sel gamet) disimpan pada suhu dibawah 0^OC dan disertai dengan pembentukan kristal-kristal es. Pembentukan kristal-kristal es dimulai pada bagian ekstraseluler. Akibatnya terjadi dehidrasi sehingga menimbulkan kekeringan yang sangat hebat dan disertai dengan kerusakan organel-organel intraseluler seperti mitokondria, lisosom dan sebagainya (Rall 1992).

Sedangkan teknik vitrifikasi adalah proses fisik berupa pemadatan medium krioprotektan berkonsentrasi tinggi selama pendinginan tanpa disertai pembentukan kristal-kristal es, dimana dalam keadaan padat distribusi ion-ion dan molekul tetap seperti dalam fase cair.

Medium yang digunakan harus memiliki tiga sifat umum, yaitu larutan mengandung krioprotektan intraseluler dengan konsentrasi tinggi, larutan membutuhkan garam-garam fisiologis dan mengandung makromolekul untuk meningkatkan kemampuan larutan untuk mengalami supercooling (Niemann 1991). Teknik ini memiliki kelebihan yaitu sederhana, dapat diandalkan dan relatif mudah diaplikasikan dilapangan karena tidak memerlukan alat khusus.

KRIOPROTEKTAN

Masalah utama selama kriopreservasi selular adalah paparan suhu rendah, mekanik dan efek fisik dari kristal es dan perubahan larutan ekstraseluler, yang akibatnya mengubah lingkungan intraseluler. Kerusakan yang disebabkan oleh efek larutan dapat dikontrol dengan meningkatkan kecepatan pembekuan, sehingga mengurangi waktu antara pembekuan solusi ekstra dan intra-seluler. Di sisi lain, efek pembekuan intraselular dapat diminimalkan dengan mengurangi kecepatan pembekuan, dan dengan demikian menekan pembentukan kristal. Oleh karena itu, setiap jenis sel memiliki tingkat pembekuan maksimum yang menyeimbangkan efek ekstra - dan intra – sel.

Beberapa zat cryoprotective telah digunakan untuk meminimalkan kerusakan sel yang terjadi dalam nitrogen cair. Ada dua jenis cryoprotectors: mereka yang menembus sel-sel (intra seluler) seperti dimethyl sulfoxide (DMSO) etilen glikol (EG) (Kusdianoro et al 2005), gliserol, sukrosa, methanol, glukosa, 1.2 propanediol (Supriatna et al 1999), proline, glycine betaine, fruktosa, galaktosa and laktosa, dan yang merupakan krioprotektor tidak masuk sel (ekstraseluler), seperti kuning telur, maltosa (Yulnawati et al 2010)

Kecepatan, bukan hanya beku tapi juga leleh, bisa mengganggu sel hidup. Rall, Fahy (1985) kristal es terbentuk ditemukan di sitoplasma embrio tikus yang secara perlahan dipanaskan. Kristal tidak terbentuk selama pembekuan. Selanjutnya, suhu kritis untuk pembentukan kristal -65°C. Jika sampel dipanaskan perlahan-lahan sampai - 85°C dan kemudian dipanaskan dengan cepat, tidak membentuk kristal.

KRIOPRESERVASI LEUKOSIT

Tujuan penelitian ini adalah menstandarisasi teknik penyimpanan leukosit untuk digunakan dalam Sitogenetika, yang akan memfasilitasi pengumpulan bahan hewan di lapangan. Metode yang dilakukan dengan mengambil 10 ml darah kambing (Ovis aries) dikumpulkan dalam tabung heparintreated. Darah disentrifugasi pada 1000 rpm selama 5 menit dan kemudian disimpan pada suhu 4°C selama 15 sampai 30 menit sehingga terbentuk penggumpalan dari cincin leukosit. Cincin leukosit dikoleksi ± 1 ml dengan pipet Pasteur dan disimpan dalam medium kultur dengan cryoprotector hingga mencapai 4 ml. Media berikut diuji: VYM, Hank,s, McCoy’s, Ham’s F10 dan serum kuda yang telah diinaktifkan,  DMSO (6%-12%), PVP (10%), dan antibiotik. Solusi sel kemudian disimpan dalam sedotan (pipet)  0,5 ml untuk menit 0,10-30 menit di refrigerator, 0-15 menit dalam freezer, 0-15 menit dalam uap nitrogen cair (1-2 cm di atas permukaan nitrogen). Kemudian bahan direndam dalam nitrogen cair, selama seminggu sampai enam bulan (Durate et al 1999).

Thawing dilakukan oleh salah satu dari dua prosedur: Rendam sedotan (pipet) dalam air pada suhu kamar sampai benar-benar cair, atau membuka sedotan (pipet)  dan menyimpan bahan masih beku dalam medium kultur. Tujuan yang kedua adalah untuk mencairkan cryoprotector berpotensi racun sebelum dimulainya metabolisme sel. Media yang digunakan adalah Ham’s F10 dengan 20% serum kuda inaktif, 5% phytohemagglutinin, 100 IU/ml penisilin dan 0,1 mg/ml streptomisin. Sel diinkubasi pada 37.5°C selama 72-120 jam, dan kemudian menggunakan teknik sitogenetika untuk memblokir sel dalam metafase oleh colchicine, hypotonization, pengaturan dan mount slide

Media dasar kultur diuji, hasil terbaik diperoleh dengan McCoy, dan VIM. DMSO hanya sebagai cryoprotector dalam medium pembekuan mampu melindungi sel-sel efek cryogenic, namun hasil terbaik diperoleh dengan asosiasi DMSO (6,25%) dan PVT (10%). Penambahan 20% serum kuda inaktif  dalam medium pembekuan juga dapat meningkatkan hasil akhir (Durate et al 1999).

Protokol pembekuan terbaik adalah 4°C selama 30 menit diikuti 15 menit dalam uap nitrogen cair sebelum perendaman dalam nitrogen cair (Durate et al 1999).

Protokol thawing terbaik adalah penempatan masih beku ke dalam medium kultur pada suhu kamar (Durate et al 1999).

Medium pembekuan: 3mL medium McCoy's, 0.8ml serum kuda inaktif, 0.25ml DMSO, 400 mg PVP, 0.4mg streptomisin dan 400 unit penicillin. Teknik kultur ini digunakan dengan sekitar 1000 sel, dengan tingkat keberhasilan rata-rata 20%.

SIMPULAN

Kriopreservasi dapat dilakukan dengan teknik (1) konvensional, dimana dilakukan secara lambat (slow freezing) serta terbentuknya kristasl es dan (2) vitrivikasi, dilakukan secara cepat, menggunankan nitrogen cair dan krioprotektan dengan konsentrasi tinggi. Krioprotektan digunakan untuk meminimalkan kerusakan sel yang terjadi dalam nitrogen cair. Krioprotektan terdiri dari 2 jenis; (1) intraseluler, sepetri dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol, sucrose, trehalose, methanol, glucose, 1.2 propanediol, proline, glycine betaine, fructose, galactose and lactose, dan (2) ekstraseluler seperti kuning telur, pati etil dekstran hidroksi, dan polivinil (PVP). Kecepatan proses pembekuan dan thawing juga bisa merusak sel. Protokol kriopreservasi bervariasi dengan tipe sel.